Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.libero accesso alla ricerca scientifica e medicaRiviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso aperto.Dove Medical Press è un membro dell'OAI.Ristampe di massa per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione rapida dei documenti.Registra i tuoi dettagli specifici e i farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Riviste » International Journal of Nanomedicine » Volume 17Autori Zhou J, Xiang H, Huang J, Zhong Y, Zhu X, Xu J, Lu Q, Gao B, Zhang H, Yang R, Luo Y, Yan FPubblicato il 5 dicembre 2022 Volume 2022:17 Pagine 5933—5946DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S364381Revisione tramite singola peer review anonimaEditor che ha approvato la pubblicazione: Dr Ebrahim MostafaviJie Zhou,1,2 Hongjin Xiang,1,2 Jianbo Huang,1,2 Yi Zhong,3 Xiaoxia Zhu,1,2 Jinshun Xu,1,2 Qiang Lu,1,2 Binyang Gao,1,2 Huan Zhang,1 ,2 Rui Yang,1,2 Yan Luo,1,2 Feng Yan1,2 1Dipartimento di ecografia, Ospedale della Cina occidentale dell'Università di Sichuan, Chengdu, Repubblica popolare cinese;2Laboratorio di ecografia, Ospedale della Cina occidentale dell'Università di Sichuan, Chengdu, Repubblica popolare cinese;3Laboratory of Mitochondria and Metabolism, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, People's Republic of China Corrispondenza: Feng Yan, Laboratory of Ultrasound Imaging, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, People's Republic of China, Tel/Fax +86 028 8516 4146, Email [email protected] Yan Luo, Ultrasound Department, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, People's Republic of China, Tel/Fax +86 028 8542 3192, Email [email protected] Scopo: preparare agenti di contrasto per ultrasuoni su scala nanometrica ( Nano-UCA) ed esaminare il ruolo della loro carica superficiale nell'attivazione del complemento e nella fagocitosi.Materiali e metodi: abbiamo analizzato le proteine ​​sieriche presenti nella corona formata su Nano-UCA e valutato due importanti marcatori proteici di attivazione del complemento (C3 e SC5b-9).L'effetto della carica superficiale sulla fagocitosi è stato ulteriormente valutato utilizzando i macrofagi THP-1.Risultati: Quando i Nano-UCA sono stati incubati con siero umano, sono stati opsonizzati da varie proteine ​​del sangue, specialmente C3.I Nano-UCA ad alta carica, positivi o negativi, sono stati favorevolmente opsonizzati dalle proteine ​​del complemento e fagocitati dai macrofagi.Conclusione: i nano-UCA caricati mostrano una maggiore tendenza al sistema del complemento attivato e sono inghiottiti in modo efficiente dai macrofagi.I risultati attuali forniscono approfondimenti significativi sul ruolo della carica superficiale delle nanoparticelle nell'attivazione del sistema immunitario innato, che è importante non solo per la progettazione di Nano-UCA mirati, ma anche per l'efficacia e la sicurezza di altri agenti teranostici.Graphical Abstract: Parole chiave: agenti di contrasto per ultrasuoni su scala nanometrica, carica superficiale, corona proteica, attivazione del complemento, opsonizzazione, fagocitosiGli agenti di contrasto per ultrasuoni (UCA) sono generalmente microbolle piene di gas (MB) con un diametro di 1-8 μm, che possono oscillare interagendo con l'onda ultrasonica migliorando così il segnale ultrasonico riflesso e sono stati utilizzati nell'imaging clinico per decenni. 1-3 I MB tradizionali sono abbastanza piccoli da circolare liberamente nei capillari, ma troppo grandi per fuoriuscire dai vasi sanguigni per fornire farmaci al tessuto.Negli ultimi anni, gli agenti di contrasto a ultrasuoni su scala nanometrica (Nano-UCA) sono emersi come un efficace sistema di somministrazione di farmaci per l'imaging molecolare e la terapia target, grazie alle loro proprietà reattive agli stimoli esterni.4,5 Con una dimensione di centinaia di nanometri, Nano- Gli UCA possono fuoriuscire dai vasi sanguigni e accumularsi nel tessuto tumorale grazie all'aumento della permeabilità e dell'effetto di ritenzione. Gli UCA hanno molti usi potenziali, che coprono un ampio spettro di ricerca biomedica che può essere tradotta in future applicazioni teranostiche, come l'imaging molecolare,9,10 la terapia guidata dalle immagini,11 i farmaci mediati dagli ultrasuoni e la consegna genica,12,13 attivati ​​dagli ultrasuoni immunoterapia,14,15 e biosensori.16 Sono stati sviluppati numerosi progetti UCA, inclusi liposomi ecogenici,17 nanogoccioline o nanoemulsioni,18 micelle,19 e nanobolle piene di gas.20 La composizione chimicaLa posizione di queste nanoparticelle può essere messa a punto in base alle proprietà fisico-chimiche e biologiche del composto attivo e alla loro applicazione prevista.Il guscio esterno dei Nano-UCA è solitamente composto da diverse molecole anioniche, cationiche e neutre (fosfolipidi, polimeri, tensioattivi, ecc.).Gli UCA anionici sono generalmente usati per somministrare farmaci antitumorali (ad es. doxorubicina, paclitaxel, ecc.).21,22 Gli UCA cationici possono essere rivestiti elettrostaticamente con acidi nucleici e utilizzati nella sonoporazione per il rilascio genico.23 Le proprietà della carica superficiale sono importanti non solo per il stabilità delle nanoparticelle (NP) in vitro ma anche per la loro emivita ematica in vivo.La carica superficiale delle NP è generalmente caratterizzata attraverso il potenziale zeta, che è esibito da qualsiasi particella in sospensione, così come dalle macromolecole e dalle superfici dei materiali.24 La misurazione del potenziale zeta è una tecnica standard per valutare la carica superficiale delle NP e prevedere la loro stabilità in vitro.25 Tuttavia, pochi studi hanno riportato il ruolo della carica superficiale o del potenziale zeta delle NP nel sistema immunitario innato.Il sistema immunitario innato, compresa la rete del complemento e il sistema fagocitico mononucleare (MPS), è la prima linea di difesa contro l'invasione di virus, batteri e sostanze estranee come micro e nanoparticelle.26 Dopo la somministrazione endovenosa, le NP sono rapidamente coperto dalle proteine ​​del sangue (opsonine) per formare una "corona proteica", in un processo chiamato opsonizzazione.Questo processo aiuta le cellule immunitarie a riconoscere le NP.La proteina del complemento 3 (C3) è al centro della reazione legata all'enzima del complemento, che coinvolge tutte le vie di attivazione del complemento.All'attivazione, C3 produce importanti opsonine, come C3b e i suoi frammenti (iC3b e C3dg).27 I fagociti (neutrofili o macrofagi) possono riconoscere le NP marcate con opsonine tramite i loro recettori sulla superficie cellulare ed eliminarle dal flusso sanguigno.28La composizione della corona proteica dipende dalla superficie e dalle proprietà fisico-chimiche delle NP.29 Studi precedenti hanno valutato le interazioni delle proteine ​​plasmatiche o sieriche con varie NP, ad esempio nanotubi di carbonio,30,31 micelle,32 liposomi,33 nanosfere polimeriche ,34,35 ossido di ferro,36 e NP d'oro.37 Per quanto ne sappiamo, non sono stati pubblicati studi sistematici sull'opsonizzazione e l'attivazione del sistema del complemento indotta da UCA (microbolle, nanoemulsioni o nanogoccioline).Il guscio delle UCA è generalmente composto da un monostrato sottile e morbido di fosfolipidi e polimeri derivati ​​dai lipidi.38,39 Il nucleo gassoso o liquido conferisce alle UCA un'elevata fluidità e deformabilità, rendendole molto diverse da altri tipi di NP con poca o nessuna deformabilità.L'identificazione dei materiali utilizzati per preparare i Nano-UCA e la comprensione della loro interazione con il sistema immunitario sono la chiave per la loro riuscita traduzione clinica.È ben noto che le dimensioni, la forma, l'idrofobicità e il rivestimento di polietilenglicole (PEG) delle NP sono fattori importanti che influenzano le loro interazioni con il sistema immunitario.40-42 Tuttavia, si sa poco sul ruolo della carica superficiale delle nanoparticelle -UCA in queste interazioni.In questo studio, abbiamo studiato il ruolo della carica superficiale dei Nano-UCA nell'opsonizzazione, nell'attivazione del complemento e nella fagocitosi.Il processo di attivazione del complemento è stato valutato identificando la composizione della corona proteica dei Nano-UCA e quantificando la produzione di C3 attivato e del complesso terminale del complemento SC5b-9.L'interazione di Nano-UCA con cellule immunitarie è stata studiata osservando la fagocitosi di NP utilizzando macrofagi THP-1 attivati.Ci si aspetta che i risultati del presente studio forniscano spunti utili per comprendere il ruolo degli agenti di contrasto ecografici su scala nanometrica nella risposta immunitaria.Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato e lo studio è stato approvato dal Comitato etico del West China Hospital dell'Università di Sichuan (n. 2021889).Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.Campioni di sangue intero dalla vena cubitale mediana sono stati raccolti da donatori di sangue sani presso il Dipartimento di ecografia, West China Hospital, Università di Sichuan.I campioni sono stati coagulati a temperatura ambiente per 2 ore e poi centrifugati a 2000 g per 20 minuti per separare il siero.Il fosfolipide neutro 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC, S01004 AVT Pharmaceutical Co., Ltd, Shanghai, Cina) è stato utilizzato come componente principale del guscio dei Nano-UCA.Per preparare Nano-UCA neutri (Neu), una quantità molare del 5% di 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metossi (polietilenglicole)-2000] (DSPE-mPEG2000, F01008 AVT Pharmaceutical Co ., Ltd) è stato aggiunto a DPPC per prevenire l'aggregazione in vitro e fornire anche proprietà invisibili ai Nano-UCA.Per preparare Nano-UCA con un guscio carico, o il lipide caricato negativamente 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-l-serina (DPPS, S04002 AVT Pharmaceutical Co., Ltd) o il colesterolo caricato positivamente 3β- La molecola di cloridrato di carbammato di N-(dimetilamminoetil) (DC-CHOL, O02003 AVT Pharmaceutical Co., Ltd) è stata ulteriormente aggiunta ai Nano-UCA neutri.La composizione e la nomenclatura delle diverse formulazioni utilizzate in questo studio sono mostrate nella Tabella 1. I nano-UCA sono stati sintetizzati utilizzando un metodo di idratazione a film sottile, come descritto di seguito.Le materie prime richieste sono state pesate e miscelate secondo la percentuale molare nella Tabella 1, quindi sciolte in cloroformio a 5 mg/mL utilizzando un pallone a fondo tondo.Il solvente è stato evaporato sotto vuoto in un evaporatore rotante a 50 ℃ fino a quando si è formato ed essiccato un film lipidico sottile ed omogeneo.Al film lipidico è stata aggiunta soluzione salina sterile (1 mg/mL) e la miscela è stata dispersa a 50 ℃ utilizzando un pulitore ad ultrasuoni (SB-3200-DTD, Scientz Biotechnology Co., Ltd, Ningbo, Cina).Cinque millilitri della sospensione ottenuta sono stati quindi posti in un bagno di ghiaccio per 5 minuti e miscelati con 1 mL di perfluoroesano (C6F14, Strem Chemicals, Inc., Newburyport, USA).La miscela è stata sonicata utilizzando uno strumento di oscillazione ultrasonica (SCIENTZ-IID, Scientz Biotechnology Co., Ltd) per 5 minuti a 300 W e un ciclo di lavoro del 50% per generare le nanoparticelle.La sospensione di NP è stata estrusa attraverso una membrana in policarbonato (PCTE) (dimensione del filtro 0,8 µm, ϕ = 19,05 mm, 100/PK, SterliTech CO, Washington, USA) utilizzando un estrusore manuale (Genizer LLC, California, USA).La sospensione risultante di Nano-UCA è stata conservata a 4 ℃ fino all'uso.Sono state ottenute immagini di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per ispezionare la forma dei Nano-UCA (microscopio elettronico Tecnai G2 F20 S-TWIN, FEI, Inc., Hillsboro, USA).La dimensione e il potenziale zeta delle NP sono stati misurati utilizzando un analizzatore PALS NanoBrook 90plus (Brookhaven, Inc., New York, USA).La concentrazione di NP è stata misurata da uno strumento ZetaView (Particle Metrix, Kassel, Germania) e quindi regolata a 1 × 1012 o 1 × 1010 particelle/mL per esperimenti successivi.Tabella 1 La composizione e la nomenclatura dei nano-UCA con diversa carica superficialeTabella 1 La composizione e la nomenclatura dei nano-UCA con diversa carica superficialeIl sistema di dosaggio si basa sui metodi di Chen F e Vu Vivian P.36,43 Una concentrazione 1×1012 particelle/mL di Neu Nano-UCA in soluzione salina è stata miscelata con campioni di siero ottenuti da tre donatori di sangue in un rapporto volumetrico di 1:3 (v/v).Al termine dell'incubazione (37 ℃, 1 h), le nanoparticelle sono state recuperate e lavate tre volte mediante centrifugazione a 100.000 g in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con Ca2+/Mg2+ per 5 minuti utilizzando un'ultracentrifuga Beckman Optima TLX.I pellet depositati nel siero sono stati lavati con 100 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 2% per 1 ora a temperatura ambiente per estrarre le proteine ​​che compongono la corona.Il surnatante proteico è stato recuperato mediante ultracentrifugazione aggiuntiva e conservato in aliquote congelate a -80 ℃ fino all'uso.Le proteine ​​adsorbite recuperate dalla superficie dei Neu Nano-UCA sono state miscelate con un tampone di caricamento del campione non riducente (P0016N, Native Gel Sample Loading Buffer, 5X, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina) e caricate (20 μL per corsia) su 4 % stacking di gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide.È stata quindi eseguita l'elettroforesi (70 V per 20 min);le risultanti strisce di gel di proteine ​​intere sono state accuratamente tagliate utilizzando una lama chirurgica usa e getta.All'interno delle strisce di gel, le proteine ​​sono state disidratate utilizzando acetonitrile (ACN), ridotte, alchilate con ditiotreitolo e iodoacetammide e quindi digerite in peptidi utilizzando tripsina.I peptidi (8 μg) sono stati risolubilizzati in acido formico (FA) allo 0,1% e analizzati utilizzando un sistema di spettrometria di massa (Thermo) EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA) con un sistema di spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo) nei dati- modalità di acquisizione dipendente (DDA).La colonna di separazione (75 μm × 15 cm, colonna C18 impaccata con particelle C18 da 3,0 μm) è stata utilizzata con una portata di 300 nL/min utilizzando 0,1% FA (solvente A) e 80% ACN più 0,1% FA (solvente B) con un gradiente di 78 min.Il gradiente di separazione LC era 5-8% solvente B per 8 min, 8-22% solvente B per 50 min, 22-32% solvente B per 12 min, 32-90% solvente B per 1 min e 90% solvente B per gli ultimi 7 min.Le impostazioni della sorgente ionica, inclusa la tensione di nebulizzazione, il gas di sweep e la temperatura del tubo di trasferimento ionico, sono state ottenute dalle impostazioni di messa a punto e regolate per gli stati correnti dello strumento.Per le scansioni MS1, la massa variava da m/z 350 a 1550 con una risoluzione di 60.000 (a m/z 200), un valore target per il controllo automatico del guadagno (AGC) era 1 × 106, un tempo massimo di iniezione era 50 ms, gli ioni precursore di intensità più elevata erano per l'analisi MS2 in 3 secondi, l'abbondanza minima di ioni precursore è 50.000 e l'isolamento della finestra è 2. Per la scansione MS2, l'energia di collisione HCD normalizzata era del 35%, la risoluzione era 15.000 (a m /z 200), il valore target AGC è stato impostato su 5 × 104 e il tempo massimo di iniezione è stato di 80 ms.La lente RF era del 30% e gli spettri sono stati raccolti in modalità profilo (MS1) e in modalità centroide (MS2).Le analisi qualitative e quantitative degli spettri MS sono state eseguite utilizzando il software Maxquant e la piattaforma "Wu Kong" (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).Al fine di studiare il legame del C3 attivato ai Nano-UCA con differenti cariche superficiali, 1×1012 particelle/mL di Nano-UCA neutri e carichi sono stati miscelati con campioni di siero umano in rapporto 1:3 (v/v) per preparare il surnatante proteico.Per ciascun campione, aliquote da 20 μL sono state miscelate con tampone di caricamento per elettroforesi su gel di poliacrilammide di dodecil solfato di sodio non riducente (SDS-PAGE) e bollite per 5 minuti.Le proteine ​​bollite sono state separate elettroforeticamente dal gel Tris-Gly all'8% e trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF).La membrana è stata bloccata usando latte in polvere scremato al 5% (p/p) in 1 × PBS con 0,1% Tween-20 (PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente e sondata con corrispondenti anticorpi primari (anticorpo monoclonale di topo sollevato contro fattore del complemento umano attivato C3, I3/15 sc-47687, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, USA) a 4 ℃ durante la notte, seguito dal lavaggio della membrana tre volte con soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,05% di Tween-20 (TBS- T).Infine, i campioni risultanti sono stati incubati per 1 ora con i corrispondenti anticorpi secondari contro le specie anticorpali primarie (proteina legante la catena leggera IgGκ di topo coniugata con perossidasi di rafano (HRP), sc-516102, Santa Cruz).I segnali della banda proteica sulla membrana PVDF sono stati visualizzati utilizzando un imager a chemiluminescenza (ChemiDoc™ MP, Bio-Rad System, Inc., Hercules, USA).Prima e dopo l'incubazione con Nano-UCA, il siero è stato analizzato per determinare i livelli di SC5b-9 utilizzando un kit ELISA (MicroVue SC5b-9 Plus EIA, Quidel Corporation, San Diego, USA).Per quantificare i livelli di SC5b-9, abbiamo utilizzato gli standard della serie SC5b-9 con concentrazioni di 10, 40, 110 e 170 ng/mL, secondo le istruzioni del produttore.Standard e campioni sono stati aggiunti a pozzetti per microsaggio pre-rivestiti con anticorpo monoclonale specifico anti-SC5b-9.Dopo 1 ora di incubazione, è stato eseguito un ciclo di lavaggio per rimuovere i materiali non legati.Anticorpi coniugati con HRP agli antigeni su SC5b-9 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto.L'incubazione con anticorpi coniugati con HRP per 30 minuti è stata quindi seguita da un altro ciclo di lavaggio.Infine, a ciascun pozzetto è stato aggiunto un substrato enzimatico cromogenico.Dopo aver reagito con gli anticorpi coniugati HRP legati, il substrato è diventato blu.È stato quindi aggiunto un reagente per arrestare lo sviluppo del colore, risultando in un colore giallo.I valori di assorbanza standard e del campione (A450) sono stati misurati da un lettore di micropiastre (Synergy HT, Bio-Tek, Vermont USA).L'analisi quantitativa dei campioni è stata eseguita interpolando i risultati A450 utilizzando l'equazione di regressione lineare della curva standard.Le cellule THP-1 pro-monocitiche umane (CC1904, CellCook Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Cina) e le cellule NCI-H1299 di carcinoma polmonare umano non a piccole cellule (CC0203, CellCook Biotechnology Co., Ltd.) sono state regolarmente coltivate in Terreno RPMI 1640 (22.400–089, Gibco, Karlsruhe, Germania), contenente il 10% (v/v) di siero di vitello fetale inattivato al calore (10.100–147, Gibco) integrato con 10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 unità/mL di streptomicina ( 15,140-122, Gibco).Le cellule sono state mantenute a 37 ℃ in un'atmosfera umidificata al 95% di aria e al 5% di CO2.Per valutare l'assorbimento di Nano-UCA da parte dei macrofagi, le cellule THP-1 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti da 35 mm a una densità di 1 × 106 cellule/pozzetto in presenza di 100 nM di forbolo miristato acetato (PMA, P1585, Sigma, St Louis, USA) e lasciato attaccare alle lastre per 48 h.Dopo l'aggiunta di PMA, le cellule THP-1 differenziate sono state incubate con 1 × 1010 particelle/mL di Nano-UCA etichettati con 1,1'-diottadecil-3,3,3',3'-tetrametil-indocarbocianina (DiI) perclorato (C1036 , Beyotime Biotechnology) a temperatura ambiente per 1 h.Dopo la fluorescenza lisosomiale (C1046, Lyso-tracker red, Beyotime Biotechnology) e la fluorescenza del nucleo (C1022, Hoechst 33,342 blue, Beyotime Biotechnology), le cellule sono state fissate e visualizzate mediante microscopia a fluorescenza confocale laser (LCFM, A1R-MP, Nikon, Tokyo , Giappone).Per l'analisi quantitativa, dopo l'incubazione con Nano-UCA marcati con DiI, le cellule THP-1 sono state staccate con tripsina EDTA, raccolte e analizzate utilizzando un citometro a flusso (FACS Caliburl, BD Biosciences, Franklin Lake, USA).I Nano-UCA etichettati sono stati anche incubati con cellule NCI-H1299 non fagocitiche e osservati utilizzando LCFM, come descritto sopra.I dati sono stati analizzati utilizzando GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, CA, USA).Le differenze sono state valutate utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale seguita dal test post-hoc di Newman-Keuls per confronti tra gruppi multipli e dal test t di Student per confronti tra due gruppi.Tutti i dati quantitativi mostrati nelle figure sono presentati come media ± deviazione standard (DS).In questo studio, abbiamo preparato sette formulazioni di Nano-UCA.In particolare, Nano-UCA caricati positivamente e negativamente sono stati preparati aggiungendo diversi rapporti molari di molecole anioniche o cationiche ai campioni di Neu Nano-UCA (Tabella 1);la sintesi è illustrata nella Figura 1A.Per valutare il ruolo della carica superficiale nell'attivazione del complemento, la dimensione delle particelle e la corrispondente distribuzione sono state mantenute il più costanti possibile per tutte le formulazioni.Le immagini TEM nella Figura 1B mostrano che le particelle Nano-UCA erano quasi sferiche e avevano una dimensione di circa 500-600 nm, con una superficie morbida e liscia.La dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità (PDI) e il potenziale zeta di diverse formulazioni Nano-UCA sono mostrati rispettivamente nelle figure 1C-E.L'unica differenza significativa tra le diverse nanoparticelle è la variazione del potenziale zeta.Per i Neu Nano-UCA formulati con 95% DPPC + 5% DSPE-mPEG2000, il potenziale zeta era -0,32 ± 1,95 mV.Quando il fosfolipide anionico DPPS è stato aggiunto alla formulazione neutra, il potenziale zeta è diminuito gradualmente da -0,32±1,95 mV (0%) a -11,29±2,01 mV (25%), -22,85±10,81 mV (50%) e - 40,95±1,16 mV (75%).Al contrario, i potenziali zeta delle formulazioni contenenti 0%, 25%, 50% e 75% DC-CHOL sono aumentati gradualmente da -0,32 ± 1,95 mV a 15,80 ± 3,18 mV, 29,16 ± 7,78 mV e 51,33 ± 2,89 mV, rispettivamente.Se conservati in soluzione salina a 4 ℃, tutti i Nano-UCA sono rimasti relativamente stabili durante il periodo di prova (Figura 2).Figura 1 Sintesi e caratterizzazione di diverse formulazioni di Nano-UCA.(A) Rappresentazione schematica di Nano-UCA con varie cariche superficiali.I nano-UCA con cariche superficiali neutre, positive e negative sono stati preparati con diversi rapporti molari di DPPC (sfera blu), DC-CHOL (sfera rosa) e DPPS (sfera verde).DSPE-mPEG2000 (5 mol%, sfera viola) è stato aggiunto a tutte le formulazioni per prevenire l'aggregazione delle particelle.(B) Immagini di microscopia elettronica a trasmissione di Nano-UCA con diverse cariche superficiali.(C) Dimensione media delle particelle (nm), (D) indice di polidispersità medio (PDI) e (E) potenziale zeta medio (mV) di diverse formulazioni di Nano-UCA.Figura 2 Stabilità in vitro di Nano-UCA.(A) Dimensione media delle particelle (nm), (B) indice medio di polidispersità (PDI) e (C) potenziale zeta medio (mV) di diverse formulazioni in soluzione salina a 1, 2, 4, 7 e 14 giorni.Ogni punto rappresenta la media ± SD di tre repliche.Figura 1 Sintesi e caratterizzazione di diverse formulazioni di Nano-UCA.(A) Rappresentazione schematica di Nano-UCA con varie cariche superficiali.I nano-UCA con cariche superficiali neutre, positive e negative sono stati preparati con diversi rapporti molari di DPPC (sfera blu), DC-CHOL (sfera rosa) e DPPS (sfera verde).DSPE-mPEG2000 (5 mol%, sfera viola) è stato aggiunto a tutte le formulazioni per prevenire l'aggregazione delle particelle.(B) Immagini di microscopia elettronica a trasmissione di Nano-UCA con diverse cariche superficiali.(C) Dimensione media delle particelle (nm), (D) indice di polidispersità medio (PDI) e (E) potenziale zeta medio (mV) di diverse formulazioni di Nano-UCA.Figura 2 Stabilità in vitro di Nano-UCA.(A) Dimensione media delle particelle (nm), (B) indice medio di polidispersità (PDI) e (C) potenziale zeta medio (mV) di diverse formulazioni in soluzione salina a 1, 2, 4, 7 e 14 giorni.Ogni punto rappresenta la media ± SD di tre repliche.Per studiare la composizione della corona proteica che copre i Neu Nano-UCA, abbiamo eseguito l'analisi MS delle proteine ​​sieriche legate ai Nano-UCA (Figura 3A e Tabella 1 supplementare).C3 era tra le proteine ​​più abbondanti in tutti e tre i campioni di siero testati.Per studiare ulteriormente l'influenza della carica superficiale sull'opsonizzazione, il C3 attivato nella corona proteica è stato determinato utilizzando l'analisi Western blot (WB).La Figura 3B suggerisce che il C3 attivato era legato a un cluster proteico piuttosto che alla sola superficie Nano-UCA: il C3 attivato eluito di tutti i Nano-UCA caricati in superficie mostrava un modello imbrattato ad alto peso molecolare (≥270 kDa), rispetto a quella del C3 purificato con un peso molecolare di 195 kDa.L'esperimento è stato ripetuto tre volte utilizzando tre diversi campioni di siero.Sulla base della densità integrata (ID) calcolata dal valore di grigio (punti per pollice, Figura 3C) della banda C3 WB attivata dal software ImageJ (versione 1.51j8, National Institutes of Health, USA), i Nano-UCA neutri hanno adsorbito il quantità minima di C3 attivato (836,45 ± 320,34 ID).I Nano-UCA con una carica inferiore legavano una quantità relativamente bassa di C3 attivato, con 3490,56 ± 1450,29 ID e 1481,39 ± 40,59 ID per il 25% di carica negativa e il 25% di carica positiva, rispettivamente.I Nano-UCA al 50% (-) e al 50% (+) hanno adsorbito una quantità maggiore di C3 attivato rispetto ai campioni a carica inferiore, con 6072,28 ± 1049,22 ID e 4145,03 ± 286,69 ID rispettivamente per i Nano-UCA caricati negativamente e positivamente .I Nano-UCA ad alta carica hanno adsorbito la quantità più elevata di C3 attivato, con 19.448,67 ± 522,58 ID e 18.775,48 ± 1950,21 ID rispettivamente per il 75% (-) e il 75% (+) di Nano-UCA.Figura 3 Ruolo della carica superficiale degli agenti di contrasto ad ultrasuoni su scala nanometrica nell'attivazione del sistema del complemento e della fagocitosi.(A) Corona proteica formata su Neu Nano-UCA: mappa termica delle prime 30 proteine ​​identificate nelle corone.Le proteine ​​sono classificate in base al logaritmo del punteggio di confidenza determinato dal numero di peptidi e dalla qualità degli spettri MS.(B) Bande non riducenti Western blot di C3 attivato legate a superfici Nano-UCA caricate in modo diverso nei campioni di siero.L'esperimento è stato ripetuto tre volte utilizzando tre diversi campioni di siero.(C) Analisi dei valori di grigio delle bande WB di C3 attivato.L'esperimento è stato ripetuto tre volte utilizzando tre diversi campioni di siero.I dati sono mostrati come media ± DS (*** P <0,001).(D) Saggio immunosorbente legato all'enzima per il rilevamento quantitativo di SC5b-9 umano.Il grafico nell'angolo in alto a destra mostra la curva standard di SC5b-9 e l'istogramma sottostante mostra la quantità di SC5b-9 prodotta in campioni di siero incubati con Nano-UCA a carica diversa.La colonna di controllo mostra i livelli di SC5b-9 nel siero prima dell'incubazione con Nano-UCA.I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti ripetuti.(E) Effetti della carica superficiale (potenziale zeta, mV) sui livelli di C3 attivato (determinato mediante analisi Western blot, blu) e SC5b-9 (determinato mediante ELISA, rosso) nel siero dopo incubazione con Nano-UCA.Per una data formulazione di Nano-UCA, ogni coppia di dati nella figura rappresenta una misurazione individuale.Figura 3 Ruolo della carica superficiale degli agenti di contrasto ad ultrasuoni su scala nanometrica nell'attivazione del sistema del complemento e della fagocitosi.(A) Corona proteica formata su Neu Nano-UCA: mappa termica delle prime 30 proteine ​​identificate nelle corone.Le proteine ​​sono classificate in base al logaritmo del punteggio di confidenza determinato dal numero di peptidi e dalla qualità degli spettri MS.(B) Bande non riducenti Western blot di C3 attivato legate a superfici Nano-UCA caricate in modo diverso nei campioni di siero.L'esperimento è stato ripetuto tre volte utilizzando tre diversi campioni di siero.(C) Analisi dei valori di grigio delle bande WB di C3 attivato.L'esperimento è stato ripetuto tre volte utilizzando tre diversi campioni di siero.I dati sono mostrati come media ± DS (*** P <0,001).(D) Saggio immunosorbente legato all'enzima per il rilevamento quantitativo di SC5b-9 umano.Il grafico nell'angolo in alto a destra mostra la curva standard di SC5b-9 e l'istogramma sottostante mostra la quantità di SC5b-9 prodotta in campioni di siero incubati con Nano-UCA a carica diversa.La colonna di controllo mostra i livelli di SC5b-9 nel siero prima dell'incubazione con Nano-UCA.I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti ripetuti.(E) Effetti della carica superficiale (potenziale zeta, mV) sui livelli di C3 attivato (determinato mediante analisi Western blot, blu) e SC5b-9 (determinato mediante ELISA, rosso) nel siero dopo incubazione con Nano-UCA.Per una data formulazione di Nano-UCA, ogni coppia di dati nella figura rappresenta una misurazione individuale.I livelli sierici di SC5b-9 sono stati misurati per valutare l'effetto dei Nano-UCA sull'attivazione del complemento.Per determinare la concentrazione di SC5b-9, è stata ottenuta una curva standard utilizzando i campioni standard forniti con il kit SC5b-9 Plus EIA.La pendenza, l'intercetta e il coefficiente di correlazione della linea di best-fit rientravano negli intervalli specificati dal produttore (y = 0,007466x + 0,2036, r = 0,997).La figura 3D rivela che una maggiore carica superficiale ha portato ad un aumento della produzione di SC5b-9 nel siero.Ad esempio, la quantità di SC5b-9 prodotta dai Neu Nano-UCA era di 19,84±4,70 µg/mL, mentre il 25% (-) e il 25% (+) di Nano-UCA producevano livelli di SC5b-9 di 30,41±25,69 e 23,27 ±8,82 µg/mL, rispettivamente.Per i Nano-UCA al 50% (-) e al 50% (+), le quantità prodotte di SC5b-9 erano rispettivamente di 99,85±32,70 e 47,87±1,52 µg/mL.Analogamente al C3 attivato legato ai Nano-UCA, il 75% (-) e il 75% (+) di Nano-UCA hanno prodotto le quantità più elevate di complesso SC5b-9: 152,65±3,65 e 78,64±27,93 µg/mL, rispettivamente.Questi risultati indicano una correlazione significativa tra C3 attivato, SC5b-9 e la carica superficiale dei Nano-UCA (Figura 3E), suggerendo che l'attivazione del sistema del complemento da parte dei Nano-UCA dipende dalla loro carica superficiale.Per esaminare ulteriormente se i Nano-UCA sono stati semplicemente adsorbiti sulla superficie cellulare o inghiottiti dai macrofagi, le cellule THP-1 e NCI-H1299 sono state incubate separatamente con Nano-UCA marcati con DiI.Dopo aver lavato vigorosamente le cellule, quasi tutti i Nano-UCA sono scomparsi dal terreno di coltura, mentre erano ancora osservati nelle cellule THP-1 (Figura 4).L'imaging LCFM ha rivelato che i Nano-UCA erano localizzati all'interno di lisosomi verdi etichettati in modo fluorescente (Figura 4).Le figure 5A-D mostrano l'assorbimento di Nano-UCA con carica diversa da parte delle cellule THP-1.Tutti i Nano-UCA caricati hanno mostrato una forte fluorescenza rossa all'interno delle cellule THP-1 (Figura 5A).L'analisi dell'intensità media di fluorescenza (MFI) (Figura 5B) ha indicato che l'assorbimento di Nano-UCA da parte delle cellule THP-1 è aumentato significativamente con l'aumentare della densità di carica superficiale, specialmente per Nano-UCA con carica positiva del 75%.I valori MFI del 25% (-), 50% (-) e 75% (-) Nano-UCA erano rispettivamente 10,6, 11,5 e 11,9 volte superiori a quelli dei Neu Nano-UCA.Inoltre, i valori MFI del 25% (+), 50% (+) e 75% (+) Nano-UCA erano rispettivamente 9,0, 9,9 e 28,5 volte superiori a quelli dei Neu Nano-UCA.Risultati quantitativi simili sono stati ottenuti mediante citometria a flusso (Figure 5C e D).Figura 4 Microscopia confocale a scansione laser della fagocitosi di Neu Nano-UCA da parte dei macrofagi THP-1.In questo esperimento, le nanoparticelle sono state prima incubate con siero di donatore per produrre la corona proteica e poi incubate con le cellule.Anche le cellule NCI-H1299 non fagocitiche sono state incubate con lo stesso siero del donatore e utilizzate per il confronto.I Neu Nano-UCA marcati con DiI (rossi) sono stati osservati nelle cellule THP-1 dopo un lavaggio intensivo con PBS, ma non sono stati rilevati nelle cellule NCI-H1299.Figura 5 Fagocitosi di Nano-UCA con diverse cariche superficiali da parte delle cellule THP-1.(A) Immagini di microscopia a scansione laser confocale dell'assorbimento cellulare di Nano-UCA dopo l'incubazione del siero per generare corona proteica.Lisosomi di cellule THP-1, nuclei cellulari e Nano-UCA sono stati etichettati rispettivamente con coloranti fluorescenti verde, blu e rosso.Tutti i Nano-UCA sono stati incubati con cellule THP-1 per 1 ora.Barra della scala = 10 mm.(B) Quantificazione dell'assorbimento cellulare basato sui valori MFI di ciascuna cellula ottenuta dalla microscopia a scansione laser confocale.(C) Assorbimento cellulare di Nano-UCA determinato mediante citometria a flusso.(D) Assorbimento cellulare quantitativo di Nano-UCA con diverse cariche superficiali, ottenuto mediante citometria a flusso.Tutti i diritti riservati.